Un estudio reciente fue publicado en bioRxiv* El servidor de preimpresión mostró que la interferencia de ARN (ARNi) puede proteger de manera profiláctica contra el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2).
antecedentes
Las vacunas contra la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) se están desarrollando a un ritmo sin precedentes; Sin embargo, los desafíos en el suministro global, la adherencia y la alta transmisión viral han contribuido al surgimiento de nuevas variantes del SARS-CoV-2 que perpetúan las oleadas de COVID-19. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas herramientas/terapias antivirales para reducir la propagación del SARS-CoV-2 y mejorar los esfuerzos de vacunación.
Estudio y resultados
En este estudio, los investigadores muestran que los pequeños ARN de interferencia (ARNsi) conjugados con 2′-O-palmitilo (C16) confieren protección protectora contra el SARS-CoV-2. Los autores examinaron las secuencias genéticas conservadas de los virus SARS-CoV-2, SARS-CoV y el síndrome respiratorio de Oriente Medio-CoV (MERS-CoV). Se han identificado más de 1500 sitios conservados entre los genomas del SARS-CoV y el SARS-CoV-2 y nueve secuencias entre el MERS-CoV y el SARS-CoV-2. Se seleccionaron alrededor de 349 secuencias diana de ARNi, y los ARNsi correspondientes a estos loci se desarrollaron como conjugados para C16.
en el laboratorio La actividad se evaluó por transfección de indicadores duales de luciferasa. Los sitios objetivo se insertaron en el exceso de cadena de SARS-CoV-2 en las tres regiones no traducidas de Renilla luciferase como cofactores, con luciferasa de luciérnaga utilizada como control. Se identificaron 91 siRNA usando este ensayo, y los siRNA in vitro más potentes se evaluaron en el ensayo de infección por virus vivo.
Los investigadores transfectaron células Vero E6 con siRNA antes de la infección con SARS-CoV-2, y la cuantificación del virus se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa. (RT-qPCR). El ensayo de virus vivo reveló 23 ARNip con una reducción logarítmica >2 del ARN viral a una concentración de 10 nM y cuatro ARNip con una reducción logarítmica >3 a 0,1 nM (concentración más baja). No se mostró actividad de ARNip dirigida a la hebra deficiente de ARN del SARS-CoV-2.
A continuación, se evaluaron los principales candidatos de siRNA (COV-siRNA1 y COV-siRNA2) dirigidos a ORF1ab mediante el ensayo de inmunofluorescencia de proteína SARS-CoV-2 N. Estos siRNA mostraron una potente actividad antiviral de una manera dependiente de la dosis. La proteína N intracelular fue indetectable cuando los siRNA candidatos se usaron solos o en combinación a una concentración de 10 nM.
Mitad de la concentración máxima efectiva (EC .)50) para COV-siRNA1 fue 42 pm y 86 pm para COV-siRNA2. Las barreras de resistencia a los medicamentos para estos siRNA se identificaron al pasar el virus cinco veces con COV-siRNA1 solo o ambos a 5x, 10x y 20x EC.50. Los mutantes de escape de virus aparecieron con un solo tratamiento con ARNsi. Sin embargo, el tratamiento combinado presentó una barrera para la aparición de mutantes de escape, lo que indica que la combinación de dos siRNA dirigidos a sitios conservados es esencial para crear una barrera para el escape del SARS-CoV-2.
Además, los sitios de unión de siRNA en el genoma del SARS-CoV-2 se secuenciaron profundamente para comprender la baja sensibilidad del tratamiento con un solo siRNA. Se observaron mutaciones puntuales en el sitio de unión de COV-siRNA1 debido al paso en serie y no en el sitio de COV-siRNA2. En su mayoría, estas mutaciones aparecieron como una mutación de triplete de timina (TTM) en 6-8 nucleótidos antisentido (número 6-8), y en los carriles superiores, aparecieron dos mutaciones más en el NT. 10 y NT. 11. Las mutaciones fueron sustituciones de bases no sinónimas y no sinónimas. Por el contrario, no se observaron mutaciones con el tratamiento combinado en ningún sitio de unión a siRNA.
Las secuencias objetivo de COV-siRNA1 y CoV-siRNA2 en los 4386 genomas de SARS-CoV-2 disponibles públicamente se evaluaron in silico para determinar si aparecía alguna mutación en los sitios objetivo. Los autores no observaron ninguna mutación en los sitios objetivo 1 y 2 de COV-siRNA, lo que indica que estos sitios permanecieron conservados sin ninguna variación significativa, incluso en las variantes de SARS-CoV-2.
Por último, se investigó in vivo la eficacia del tratamiento de combinación de siRNA en hámsteres sirios. Se administraron dos ARNip siete días antes de la infección, y el control fue dirigido a ARNip de luciferasa. El SARS-CoV-2 se inoculó profilácticamente el día 0. El tratamiento con siRNA dio como resultado una protección dependiente de la dosis de los hámsteres contra la pérdida de peso.
Además, los hámsters se trataron por separado con dos siRNA 1 día antes de la infección. Estos animales perdieron peso al mismo ritmo que el grupo de control debido al retraso en el inicio del mecanismo. Los hámsteres tratados con siRNA 30 días antes de la infección mostraron resultados similares consistentes con los animales tratados siete días antes de la infección. Además, el tratamiento dual con ARNsi redujo los ARN genómicos y subgénicos virales en los tejidos pulmonares.
Conclusiones
El estudio actual identificó varios siRNA con sitios de unión que cubren todo el genoma del SARS-CoV-2 y observó que la combinación de objetivos CoV-siRNA1 y CoV-siRNA2 conservaba secuencias dentro de ORF1ab. Esto indica que mantener esos sitios era fundamental para la aptitud viral. Los modelos preclínicos han mostrado resultados prometedores y requieren más investigación clínica. En general, los resultados del estudio actual sugieren que la terapia combinada con siRNA puede ser fundamental para mitigar el COVID-19 y puede servir como una prevención potencial contra la enfermedad grave.
*Nota IMPORTANTE
bioRxiv publica informes científicos preliminares que no están sujetos a revisión por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica/comportamiento relacionado con la salud ni tratarse como información establecida.
