La nanotecnología permite la visualización de estructuras de ARN con precisión subatómica

Vivimos en un mundo hecho y administrado por el ARN, la molécula hermana del ADN que es tan importante como el ADN genético. De hecho, los biólogos evolutivos postulan que el ARN estaba presente y se autorreplicaba incluso antes del advenimiento del ADN y las proteínas codificadas por él. Avance rápido a los humanos modernos: la ciencia ha revelado que menos del 3% del genoma humano se transcribe en moléculas de ARN (ARNm) que a su vez se traducen en proteínas. Por el contrario, el 82% se transcribe en moléculas de ARN con otras funciones, muchas de las cuales siguen siendo un misterio.

Para comprender lo que hace una molécula de ARN individual, su estructura tridimensional debe descifrarse al nivel de sus átomos constituyentes y enlaces moleculares. Los investigadores estudian de forma rutinaria el ADN y las moléculas de proteínas convirtiéndolas en cristales empaquetados regularmente que pueden examinarse mediante rayos X (cristalografía de rayos X) u ondas de radio (resonancia magnética nuclear). Sin embargo, estas técnicas no se pueden aplicar a las moléculas de ARN con la misma eficacia porque su estructura molecular y su flexibilidad estructural les impiden formar cristales con facilidad.

Ahora, una colaboración de investigación dirigida por el miembro de la facultad Wyss Core Peng Yin, Ph.D. en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard, y Maofu Liao, Ph.D. En la Facultad de Medicina de Harvard (HMS), informo sobre un enfoque fundamentalmente nuevo para la investigación estructural de las moléculas de ARN. ROCK, como se le llama, utiliza nanotecnología de ARN que le permite ensamblar múltiples moléculas de ARN idénticas en una estructura altamente organizada, lo que reduce drásticamente la flexibilidad de las moléculas de ARN individuales y duplica su peso molecular. Aplicado a modelos de ARN conocidos de diferentes tamaños y funciones como estándares, el equipo demostró que su método permite el análisis estructural de las subunidades de ARN involucradas con una técnica conocida como microscopía electrónica (crio-EM). Su progreso ha sido informado en caminos de la naturaleza.

«ROCK rompe los límites actuales de las investigaciones estructurales de ARN y permite desbloquear estructuras 3D de moléculas de ARN a las que es difícil o imposible acceder con los métodos actuales y con precisión subatómica», dijo Yin, quien dirigió el estudio junto con Liao. . «Esperamos que este avance revitalice muchas áreas de investigación básica y desarrollo de fármacos, incluido el floreciente campo de las terapias de ARN». Yin también es el líder de la Iniciativa de Robótica Molecular del Instituto Wyss y profesor en el Departamento de Biología de Sistemas en HMS.

control de ARN

El equipo de Yin en el Instituto Wyss ha ideado varios métodos que permiten que las moléculas de ADN y ARN se autoensamblen en estructuras grandes basadas en varios principios y requisitos, incluidas las plantillas de ADN y el origami de ADN. Ellos plantearon la hipótesis de que tales estrategias también podrían usarse para ensamblar moléculas de ARN naturales en complejos circulares altamente ordenados en los que su libertad para flexionarse y moverse está severamente restringida por la unión específica. Muchos ARN se pliegan de manera compleja pero predecible, con pequeñas secciones que se acoplan entre sí. El resultado es a menudo un «núcleo» estable y «anillos de tallo» que sobresalen hacia la periferia.

«En nuestro enfoque, instalamos ‘bucles de besos’ que vinculan diferentes bucles de tallo periféricos que pertenecen a dos copias idénticas de ARN de una manera que permite la formación de un bucle estable general, que contiene múltiples copias del ARN de interés», dijo Dee. Liu, PhD, uno de los primeros autores y becario postdoctoral en el Grupo Yin. «Predijimos que estos bucles altamente ordenados podrían analizarse a alta resolución mediante crio-EM, que se ha aplicado a moléculas de ARN con el primer éxito».

imágenes de ARN estables

En crio-EM, muchas partículas individuales se congelan a temperaturas extremadamente bajas para evitar cualquier otro movimiento y luego se visualizan con un microscopio electrónico y la ayuda de algoritmos computacionales que comparan diferentes aspectos de las proyecciones de superficie 2D de la partícula y reconstruyen su estructura 3D. Peng y Liu se asociaron con Liao y su exestudiante de posgrado François Thilou, quien es el otro coautor del estudio. Liao y su grupo han realizado importantes contribuciones al campo de rápido avance de la crio-EM y el análisis experimental y computacional de partículas individuales formadas por proteínas específicas.

«Cryo-EM tiene ventajas significativas sobre los métodos convencionales para ver detalles de alta resolución de moléculas biológicas, incluidas proteínas, ARN y ARN, pero el tamaño pequeño y la tendencia móvil de la mayoría de los ARN impiden la identificación exitosa de estructuras de ARN. Nuestro nuevo método para sintetizar múltiples moléculas de ARN resuelven estos dos problemas al mismo tiempo, al aumentar el tamaño del ARN y disminuir su movilidad”, dijo Liao, quien también es profesor asociado de biología celular en HMS. «Nuestro enfoque ha abierto la puerta a la rápida determinación de la estructura de muchos ARN por crio-EM». La incorporación de nanotecnología de ARN y enfoques crio-EM al equipo los llevó a llamar a su método «Crio-EM habilitado para ARN mediante la estabilización de bucles de besos» (ROCK).

Para proporcionar la prueba de principio de ROCK, el equipo se centró en un gran intrón de ARN de Tetrahymena, un organismo unicelular, y un pequeño intrón de ARN de Azoarcus, una bacteria fijadora de nitrógeno, así como en un llamado riboconmutador FMN. Los ARN de intrones son secuencias de ARN no codificantes que se encuentran dispersas en las secuencias de los ARN recién transcritos y deben «cortarse» para generar ARN maduro. El ARNt de FMN se encuentra en el ARN bacteriano involucrado en la biosíntesis de metabolitos de flavina derivados de la vitamina B2. Al unirse a uno de ellos, el mononucleótido de flavina (FMN), cambia su forma tridimensional e inhibe la síntesis del ARN original.

«Ensamblar el intrón del Grupo I de Tetrahymena en una estructura similar a un anillo hizo que las muestras fueran más homogéneas y permitió el uso de herramientas computacionales que aprovechan la simetría de la estructura combinada. Si bien nuestro conjunto de datos es relativamente modesto en tamaño, las ventajas innatas de ROCK nos permitió resolver la estructura Una decisión sin precedentes. El núcleo de ARN se resolvió a 2,85 Å [one Ångström is one ten-billions (US) of a meter and the preferred metric used by structural biologists], revelando las características detalladas de las bases de nucleótidos y la columna vertebral de azúcar. No creo que hubiéramos podido llegar allí sin ROCK, o al menos no sin muchos más recursos. »

Cryo-EM también puede capturar partículas en diferentes estados si, por ejemplo, cambian su forma 3D como parte de su función. Al aplicar ROCK al ARN del intrón Azoarcus y al riboconmutador FMN, el equipo pudo identificar las diferentes conformaciones por las que viaja el intrón Azoarcus durante el proceso de autounión y revelar la rigidez conformacional relativa del sitio de unión del riboconmutador FMN.

«Este estudio realizado por Peng Yin y sus colaboradores muestra elegantemente cómo la nanotecnología de ARN puede actuar como un acelerador para el desarrollo de otras disciplinas. La capacidad de visualizar y comprender las estructuras de muchas moléculas de ARN naturales podría tener un tremendo impacto en nuestra comprensión de muchas procesos biológicos y patológicos a través de diferentes tipos de células, tejidos y organismos, e incluso permiten nuevos enfoques para el desarrollo de fármacos”, dijo el Director Fundador de Wyss, Donald Ingber, MD, PhD.