Un método basado en PCR de alta sensibilidad para la detección de variantes del SARS-CoV-2

Un equipo de científicos con sede en el Reino Unido desarrolló recientemente un método de PCR con sonda específica de alelo que puede detectar con precisión diferentes variantes / linajes del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en muestras respiratorias. Este método puede detectar variantes virales incluso en muestras con bajo ARN viral o ARN viral degradado. El estudio está disponible actualmente en medRxiv* Servidor de preimpresión.

Stady: Discriminación de linaje de variantes hipersensibles del SARS-CoV-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa de sonda específica de alelo. Haber de imagen: Fit Ztudio / Shutterstock

antecedentes

La pandemia del nuevo coronavirus 2019 (COVID-19) se ha convertido en una importante crisis de salud pública, con 247 millones de infecciones y 5 millones de muertes. A pesar del rápido desarrollo y difusión de posibles vacunas, se ha observado un aumento continuo en la trayectoria de la pandemia a nivel mundial. Esto puede deberse a la aparición de nuevas variantes virales con múltiples mutaciones mutacionales que hacen que el virus sea resistente a los anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, la detección rápida y precisa de variantes virales es importante para rastrear la transmisión del virus y la evaluación de riesgos.

Los métodos de secuenciación del genoma completo de próxima generación se consideran el estándar de oro para la detección de variantes virales. Las muestras virales utilizadas en estos métodos deben ser de buena calidad y tener un alto nivel de ARN viral. Sin embargo, las muestras tomadas de pacientes en una etapa posterior de la infección a menudo contienen un nivel bajo de ARN viral. Además, puede producirse una rápida degradación del ARN debido a una mala manipulación de las muestras durante el transporte y el almacenamiento. Estos factores pueden limitar fundamentalmente el uso generalizado de métodos de secuenciación de próxima generación.

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En el estudio actual, los científicos desarrollaron un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCR) en tiempo real que puede detectar variantes virales incluso en muestras con bajo contenido de ARN viral o ARN degradado.

método

Este método se denomina sonda de PCR específica de alelo. Utiliza dos sondas marcadas con fluorescencia con afinidades de unión diferenciales que se dirigen a un polimorfismo de un solo nucleótido específico de variante en el genoma del SARS-CoV-2.

Los científicos utilizaron este método para detectar variantes virales en dos grupos de pacientes infectados con SARS-CoV-2. En un ensayo realizado en el Reino Unido, analizaron 717 muestras respiratorias de una manera que detectó la variante alfa del SARS-CoV-2 al apuntar a la mutación de pico D1118H. En otro experimento realizado en Brasil, analizaron 365 muestras para detectar variantes P1 y P2 al apuntar a la mutación de pico K417T y la mutación de marco de lectura abierto 1a (ORF1a) L3468V, respectivamente.

Además, compararon la sensibilidad y la especificidad del método de PCR con sonda específica de alelo con los métodos de secuenciación de próxima generación en ambos experimentos.

Notas importantes

El análisis de muestras de ambos experimentos reveló que el método de PCR con sonda específica de alelo tiene una capacidad un 25% mayor que el método de secuenciación de próxima generación para detectar variantes virales en muestras con una amplia gama de cargas virales.

El análisis de muestras con ARN viral degradado reveló que la calidad del ARN no afecta la función del método de PCR con sonda específica de alelo. Puede secuenciar eficazmente el 95% de las muestras degradadas, mientras que el método de secuenciación de próxima generación solo puede secuenciar el 0-11% de las muestras degradadas.

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Es importante destacar que tanto la sonda de PCR específica de alelo como los métodos de secuenciación de próxima generación mostraron una comparabilidad del 99% en la detección de variantes virales. Además, el método de PCR con sonda específica de alelo mostró una sensibilidad del 98% y una especificidad del 100% para la variante alfa, una sensibilidad del 90% y una especificidad del 95% para la variante P1, y una sensibilidad del 100% y una especificidad del 91% para la variante P2.

Se realizó un análisis de pre-regresión para predecir la función del método de PCR con sonda específica de alelo en una población de muestra. Los resultados revelaron que el método tiene la mayor superioridad sobre el método de secuenciación de próxima generación para detectar variantes virales en muestras con valores de Ct entre 26-30. Se predijo que el método de PCR con sonda específica de alelo secuenciaría eficazmente el 96% de estas muestras, mientras que se predijo que el método de secuenciación de próxima generación secuenciaría solo el 30-40% de estas muestras.

Estudia la importancia

El estudio describe el desarrollo de un método de PCR con sonda específica de alelo que es 99% efectivo como métodos de secuenciación de próxima generación para detectar variantes virales en muestras respiratorias. Es importante destacar que este nuevo método puede distinguir con éxito variantes en muestras con bajo nivel de ARN viral o ARN viral degradado. Otra ventaja es que el método se puede modificar fácilmente para apuntar a nuevos polimorfismos de un solo nucleótido que puedan surgir en el genoma del SARS-CoV-2 en el futuro.

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*Nota IMPORTANTE

medRxiv publica informes científicos preliminares que no han sido revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

Custodia Zayas

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