Científicos dirigidos por un equipo de la Universidad de Stanford han desarrollado un sistema CRISPR-Cas compacto y eficiente, llamado CasMINI, que tiene aproximadamente la mitad del tamaño de los sistemas CRISPR-Cas actuales, y que podría tener una amplia utilidad para aplicaciones de terapia génica, así como para ingeniería celular. . En experimentos, los investigadores confirmaron que CasMINI, al igual que sus contrapartes más grandes, puede eliminar, activar y editar las secuencias de genes diana. Pero el tamaño relativo más pequeño de CasMINI significa que debería ser más fácil de administrar a las células humanas y al cuerpo humano, lo que lo convierte en una herramienta potencial para tratar una amplia gama de trastornos, incluidas enfermedades oculares, degeneración de órganos y enfermedades genéticas.
Si bien los sistemas CRISPR de uso común, como los basados en las proteínas de unión a Cas9 y CRISPR de Cas12a, constan de aproximadamente 1000 a 1500 aminoácidos, el nuevo sistema CasMINI contiene solo 529.
«Este es un importante paso adelante para las aplicaciones de la ingeniería del genoma CRISPR», sugirió el autor principal del estudio, Stanley Key, Ph.D., profesor asistente de química y biología de sistemas en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford e investigador en Stanford ChEM-H. «El trabajo presenta el CRISPR más pequeño hasta la fecha, según nuestro conocimiento, como una tecnología de edición del genoma. Si la gente a veces piensa en Cas9 como tijeras moleculares, aquí hemos creado una navaja suiza con múltiples funciones. No es grande, pero es un mini portátil para facilitar su uso «.
Qi y sus colegas informaron sobre su desarrollo en célula molecularEn un artículo tituladoEl sistema en miniatura CRISPR-Cas diseñado para regular y editar el genoma de los mamíferos. «
Los autores escribieron que el desarrollo de sistemas CRISPR-Cas para células humanas «ha revolucionado la ingeniería del genoma». Pero si bien estos sistemas ofrecen oportunidades para desarrollar terapias génicas para una variedad de enfermedades genéticas, su gran tamaño a menudo restringe su suministro a las células, lo que potencialmente limita sus posibles aplicaciones clínicas. Por ejemplo, los vectores de virus adenoasociados (AAV) que se aplican ampliamente para la administración in vivo tienen un límite de capacidad de empaquetamiento de carga útil de menos de 4,7 kb, y muchas proteínas de fusión Cas superan este límite. «El gran tamaño de los efectores CRISPR-Cas y sus proteínas de fusión ha planteado un desafío para la ingeniería celular eficiente y la entrega in vivo», dijeron los investigadores. «… existe una gran necesidad de diseñar sistemas Cas compactos y altamente eficientes para facilitar la próxima generación de aplicaciones de ingeniería del genoma».
Una posible solución es Cas12f, también conocida como Cas14, que tiene menos de la mitad del tamaño de los sistemas CRISPR que se utilizan actualmente, como Cas9 o Cas12a. Pero hasta ahora, no estaba claro si esta proteína compacta podría usarse en células de mamíferos. «Los últimos años han identificado miles de CRISPR, que se conocen como el sistema de defensa inmunológico de las bacterias», explicó Qi. «Sin embargo, más del 99,9% de los CRISPR detectados no pueden funcionar en células humanas, lo que limita su uso como tecnologías de edición del genoma».
Para su trabajo recientemente informado, Qi y sus colegas aplicaron la ingeniería de ARN y proteínas al sistema Cas12f para crear un sistema mini-Cas eficiente para la ingeniería del genoma de los mamíferos. Al optimizar el diseño de ARN de guía única y realizar múltiples rondas de detección e ingeniería de proteínas iterativas, los investigadores crearon una clase de variantes de Cas12f llamada CasMINI.
Los investigadores decidieron comenzar con CRISPR Cas12f porque contiene solo de 400 a 700 aminoácidos. Los científicos señalaron: «El tamaño de la molécula CasMINI diseñada es de 529 aminoácidos, 62% y 57% más pequeño que SpCas9 (1368 aminoácidos) y LbCas12a (1228 aminoácidos), respectivamente. Sin embargo, como otras proteínas CRISPR, Cas12f surge naturalmente de Archaea – organismos unicelulares – lo que significa que es completamente inadecuado para las células de mamíferos, y mucho menos para las células o los cuerpos humanos. Se sabe que pocas proteínas CRISPR funcionan en células de mamíferos sin modificación. Desafortunadamente, CAS12f no es una de ellas. Eso lo convierte en un desafío atractivo para bioingenieros como Qi. «Pensamos, ‘Bueno, millones de años de evolución no han podido convertir este sistema CRISPR en algo que funcione en el cuerpo humano. ¿Podemos cambiar eso en solo uno o dos años?’ «Hasta donde yo sé, hemos convertido, por primera vez, un CRISPR que no funciona en uno que funciona».
Xiaoshu Xu, investigador postdoctoral en el laboratorio de Qi y autor principal de la investigación recientemente informada, no vio actividad de Cas12f normal en células humanas. Xu y Qi plantearon la hipótesis de que el problema es que el ADN del genoma humano es más complejo y menos accesible que el ADN microbiano, lo que dificulta que Cas12f encuentre su objetivo en las células. Al considerar la estructura computacionalmente esperada del sistema Cas12f, seleccionó cuidadosamente alrededor de 40 mutaciones de proteínas que podrían evitar esta limitación y estableció una línea para probar muchas variantes de proteínas simultáneamente. La variante de trabajo, en teoría, convertiría en verde una célula humana activando la proteína verde fluorescente (GFP) en su genoma.
“Al principio, este sistema no funcionó en absoluto durante un año”, dijo Shaw. «Pero después de las iteraciones de bioingeniería, vimos que algunas de las proteínas diseñadas comenzaban a funcionar, como por arte de magia. Realmente nos hizo apreciar el poder de la biología sintética y la bioingeniería».
Si bien los primeros resultados exitosos fueron solo modestos, el equipo se animó porque incluso los resultados modestos significaban que el sistema estaba funcionando. Durante varias iteraciones adicionales, Xu pudo mejorar el rendimiento de la proteína. «Comenzamos viendo solo dos células que mostraban una señal verde, y ahora, después de la ingeniería, casi todas las células son verdes bajo el microscopio», dijo Xu. Pero al optimizar el diseño de ARN de guía única y realizar múltiples rondas de ingeniería y detección de proteínas iterativas, los investigadores crearon una clase de variantes de Cas12f llamada CasMINI.
Además de sus esfuerzos de ingeniería de proteínas, los investigadores también diseñaron un ARN que dirige la proteína Cas a su ADN objetivo. Fueron necesarias modificaciones en ambos componentes para que el sistema CasMINI funcionara en células humanas. De manera alentadora, las variantes de la proteína Cas12f diseñadas por ingeniería, junto con los ARN de una sola guía diseñados por ingeniería, demostraron una potente actividad de regulación y edición de genes. “Al optimizar el diseño del ARN guía único (ARNsg) y realizar múltiples rondas de ingeniería y detección de proteínas iterativas, generamos una clase de variantes de Cas12f (por ejemplo, CasMINI) que, cuando se incorporan a un activador de transcripción, pueden activar de manera eficiente al informador y expresión génica endógena. ‘”, informaron los autores. Probaron la capacidad de CasMINI para eliminar y editar genes en células humanas dependientes del laboratorio, incluidos genes relacionados con la infección por VIH, la respuesta inmune antitumoral y la anemia. Funcionó en casi todos los genes que probaron, con fuertes respuestas en muchos de los genes.
Las pruebas han demostrado que CasMINI puede impulsar altos niveles de activación de genes, similares a los asociados con Cas12a, y permiten una edición sólida de bases y genes. Además, se encuentra que el sistema es muy específico y no produce efectos indetectables fuera del objetivo. Los autores señalan que «la activación génica mediada por dCasMINI tiene una mejora significativa sobre el sistema dCas12f de tipo salvaje, tiene una capacidad de activación similar con el sistema dCas12a y es específica en células de mamíferos sin objetivos detectables». «… CasMINI proporciona una herramienta útil para amplias aplicaciones de ingeniería del genoma que requieren proteínas de fusión Cas integradas para la entrega y función celular».
«Aquí convertimos CRISPR que no funciona en células de mamíferos, mediante ingeniería racional de ARN e ingeniería de proteínas, en una tecnología de trabajo altamente eficiente», dijo Chi. «Ha habido esfuerzos anteriores por parte de otros para mejorar el rendimiento de los CRISPR en funcionamiento. Pero nuestro trabajo es el primero en hacer que una persona que no funciona funcione. Esto resalta el poder de la bioingeniería para lograr algo que la evolución aún no ha logrado».
La molécula CasMINI diseñada tiene un tamaño de solo 529 aminoácidos. Este pequeño tamaño lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Las proteínas de fusión CasMINI también son adecuadas para la encapsulación de AAV. «Analizamos las fusiones de CasMINI en dominios de edición de genes, activadores y supresores ampliamente utilizados y observamos que todos estaban por debajo del límite de los paquetes de AAV (<4,7 kb)", dijeron los investigadores. Además, el ARNm de CasMINI se puede empaquetar fácilmente en nanopartículas de lípidos u otros métodos de administración de ARN, lo que potencialmente mejora su entrada en las células. "También planteamos la hipótesis de que su tamaño pequeño y su fuente de patógenos no humanos probablemente lo hagan menos inmunogénico en comparación con cargas de proteínas más grandes", agregó el equipo. "... prevemos que los efectores Cas sintéticos y compactos desarrollados en este estudio serán ampliamente útiles para aplicaciones de terapia génica e ingeniería celular".
Se necesita más trabajo para aumentar la eficiencia de CasMINI en la edición básica y de genes y para probar el rendimiento del sistema in vivo con diferentes métodos de entrega. Los investigadores planean probar el sistema en aplicaciones de terapia génica in vivo. «La disponibilidad de CasMINI en miniatura permite nuevas aplicaciones, que van desde aplicaciones in vitro como la ingeniería de mejores linfocitos asesinos de tumores o la reprogramación de células madre hasta la terapia génica in vivo para tratar enfermedades genéticas en el ojo, músculo o hígado», anotó Qi. . «Está en nuestra lista de deseos que se convierta en un tratamiento para tratar enfermedades genéticas, tratar el cáncer y revertir la degeneración de órganos».
Los investigadores ya están estableciendo colaboraciones para buscar terapias genéticas. También están interesados en cómo puede contribuir a los avances en las tecnologías de ARN, como las que se utilizan en el desarrollo de las vacunas de ARNm de COVID-19, donde el tamaño también podría ser un factor limitante.
«Esta capacidad para diseñar estos sistemas se ha requerido en este campo desde los primeros días de CRISPR, y creo que hemos hecho nuestra parte para avanzar hacia esa realidad», dijo Qi. Este enfoque de ingeniería puede resultar muy beneficioso. Eso es lo que me emociona: abrir la puerta a nuevas posibilidades «.
Los autores señalaron que, si bien los estudios anteriores utilizaron la ingeniería de proteínas para generar variantes mejoradas de Cas12a o Cas12b, el nuevo trabajo muestra que es posible diseñar potentes efectores de Cas12f a partir de un proto-sistema sin actividad detectable en células de mamíferos. “El enfoque de ingeniería de ARN y proteínas utilizado en este trabajo puede ser aplicable a la ingeniería de más efectores Cas12f / Cas14 de otras especies bacterianas o primitivas”, informan, “Estos resultados probablemente indican que varios sistemas de la familia Cas12 se pueden optimizar para lograr mejores a través de la guía de ingeniería de proteínas y ARN «.
